探针穿越血脑屏障策略和脑动力学荧光成像的进展

一、研究背景

   本综述总结了旨在穿过血脑屏障的荧光探针的最新进展，重点关注它们在检测各种活性分子中的应用。它分析了这些探针的设计策略、光谱特性、体内应用和局限性，同时还阐明了与大脑中活性物质的特异性检测相关的挑战。如图1，这些见解为未来荧光探针的设计和创新奠定了坚实的基础，并为改善中枢神经系统的药物输送和脑部疾病的早期诊断开辟了新的途径。

二、探针设计
2.1 基于 BBB 生理特性的探针优化

BBB 的物质转运依赖分子的脂溶性、分子量、电荷等特性，因此探针设计需满足：

• 脂溶性调节：通过修饰疏水基团（如烷基链、芳香环）提升脂水分配系数（clog      P），增强与 BBB     内皮细胞膜的相互作用；

• 分子量控制：将探针分子量控制在 500 Da 以下或封装于纳米载体（如脂质体、聚合物纳米粒），利用尺寸效应促进内皮细胞吞噬或胞饮作用；

• 极性与电荷优化：减少氢键供体数量、降低拓扑极性表面积（tPSA），避免因高极性被 BBB 排斥；通过表面电荷修饰（如中性或弱正电）减少与内皮细胞的非特异性吸附。

2.2 相关探针

• 受体介导的主动转运：在探针或载体表面修饰 BBB 特异性受体（如转铁蛋白受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体）的配体（如抗体、肽段），通过受体介导的内吞作用实现靶向递送；

• 转运体利用：针对 BBB 内皮细胞表达的营养转运体（如葡萄糖转运体 GLUT1），设计与底物结构类似的探针，通过竞争性转运进入脑内；

• 物理 / 化学辅助技术：如聚焦超声联合微气泡暂时打开 BBB 紧密连接、利用磁场引导磁性纳米探针靶向聚集，进一步提升探针递送效率。

（1）用于 RNS 检测的荧光探针

   RNS是生物系统中的关键信号分子，主要包括过氧亚硝酸阴离子（ONOO−）和一氧化氮（NO），它们在维持氧化还原稳态中起着关键作用。然而，RNS的过度产生会引发一系列病理过程，如氧化应激、神经元损伤和炎症反应，这些过程与血脑屏障破坏和神经退行性疾病密切相关。为了实时监测RNS的动态变化，开发高灵敏度和选择性的荧光探针至关重要。迄今为止，已经成功地使用了多种探针来检测大脑中的RNS，为研究人员提供了有关疾病机制和进展的宝贵见解。

（2）用于 ONOO⁻ 检测的荧光探针

探针1：2019年，胡等通过将硼酸酯与荧光团亚甲蓝（MB）连接起来，设计了探针1（图2）。该探针表现出优异的血脑屏障穿透性，并首次以高时间和空间分辨率揭示了孔酸盐诱导的癫痫小鼠大脑中内源性 ONOO⁻水平的动态变化。本研究建立了ONOO⁻水平与神经元损伤严重程度的正相关关系，并开发了一种抗癫痫抑制剂的高通量筛选方法。

探针2：比例双光子（TP）探头结合了比例和 TP 技术的优点，能够在内质网（ER）处直接准确地对 ONOO⁻进行单度测量。Sun等使用8-羟基萘硫胺荧光团设计了探针2（图2），以创建比例TP荧光平台。影像学检查结果显示，抑郁小鼠海马组织内质网中的ONOO⁻水平升高，为评估体内氧化状态提供了一种新方法。
探针3：一种基于理化性质的探针设计策略--硼酸酯连接的Si-罗丹明荧光团来设计探针3（图2），表现出出色的 BBB 穿透性，并能够对神经胶质瘤相关样本中的 ONOO⁻进行多尺度成像。重要的是，使用尿酸（UA）从神经胶质瘤细胞系中清除 ONOO⁻有效抑制了神经胶质瘤细胞增殖，凸显了 ONOO⁻作为神经胶质瘤生物标志物和治疗靶点的潜力。

探针5：鉴于荧光团的刚性平面结构在其发光性能中起着关键作用，苯并BODIPY支架在理化性质测试中表现出优异的性能。Cheng等选择对羟基苯胺作为ONOO⁻传感的反应触发器，并将其与苯并BODIPY支架（log P = 2.60）偶联以设计探针5（图3）。

探针7：罗等人设计了基于次磷酸二苯酯亲核裂解的探针7(图4)，为检测ONOO⁻提供了一种新的策略。探针7含有二苯基亚磷酰胺作为反应基团，二氰甲基色烯作为近红外TP荧光基团，与ONOO⁻反应在685 nm处发出荧光信号。这种探针保留了TP探针的优点。

探针8：依达拉奉（EDA）是治疗脑缺血的一线药物，缺乏用于评估其抗癫痫 phar macodynamics 的荧光探针。为了解决这个问题，Shen等开发了探针8（图4），该探针以硫代碳酸盐衍生物作为ONOO⁻识别基序。该探针表现出出色的BBB 穿透性，并能够实时监测癫痫小鼠大脑中的 ONOO⁻波动。成像显示 EDA 治疗的癫痫小鼠的荧光减弱，证实了 EDA 的强效抗癫痫活性。

探针9：为了实现ONOO⁻在脑卒中患者脑微血管系统中进行动态的高度特异性检测，Xiong等设计了探针9（图4），使用吲哚-2,3-二酮衍生物作为ONOO⁻识别基序。探针 9 在水性缓冲液和生物体中表现出优异的特异性，优于其他 ROS，解决了使用光学探针将 ONOO⁻与其他 ROS/RNS 区分开来的长期挑战。

探针10：（图4）利用了光诱导电子转移（PET）和激发态分子内质子转移（ESIPT）相结合的双重机制。附加氰基苯的二羰基单元作为ONOO⁻的PET反应位点，而羟基乙酰化用于抑制2-（2′-羟基苯基）苯并噻唑荧光团的ESIPT过程，从而改善膜通透性。

（3）用于NO检测的荧光探针

芳香族邻二胺类似物在中性和好氧条件下可与NO反应生成三唑类，或在酸性条件下与亚硝酸盐反应生成三唑类，生产三唑衍生物的条件。基于这一机制，2,3-二氨基萘（DAN）及其衍生物被广泛用作NO检测的荧光探针，因为它们与NO反应生成2,3-[H]-1-萘三唑（NAT），表现出很强的荧光弹性。

探针11：为了实现靶向高尔基体和检测NO的双重功能，He等设计了探针11（图5），该探针结合了高尔基体靶向部分（4-氨基磺酰苯甲酰胺）和邻二氨基苯NO识别基团。该探针有效地证明了AD细胞模型的高尔基体内NO水平显着增加。

探针12：Munan开发了探针12（图5），该探针利用邻二胺类似物作为识别部分，并结合了吗啉配体和碱性吡啶荧光团。该探针在活性化的HMC3细胞中表现出优异的生物相容性和溶酶体特异性，成功地可视化了SARS-CoV-2 RNA诱导的异常溶酶体NO水平。然而，这两种探针目前都仅限于体外测试。

探针13：体内应用面临的一个主要挑战是缺乏具有体内分析能力的新型、可调谐的 NIR-II 荧光载体。Xu等设计了一系列波长可调的Si-罗丹明荧光探针，这些探针在与NO反应后发生从弯曲到平面的结构转变，从而产生发射波长变化。

探针14：光声（PA）探头结合了光学和超声技术的优势，提供高空间分辨率和深层组织穿透力，使其成为活体成像的理想选择。江等开发的探针14（图5），基于具有优异BBB穿透性的CF₃BODIPY部分，并结合了NO受体（N-甲基-1,2-苯二胺）以形成供体-受体（D-A）结构支架。该探针成功用于 PD 小鼠不同大脑深度的比例 3D PA 成像，证明了其作为 PD 治疗药物筛选工具的潜力。

探针15：作为神经炎症的重要指标，在神经炎症的发展过程中，NO水平和脂滴数量都会发生显着变化。将这两者结合起来可以更准确地评估神经炎症。探针15很好的体现了该特性。

探针16：用于在神经炎性自噬过程中靶向粘度和识别NO(图5)。在两种分析物同时存在的情况下，较高的粘度抑制了苯乙炔转子的旋转，而涉及NO的亚硝化反应则阻止了PET的作用，导致红色荧光信号的开启。探针显示良好的血脑屏障通透性(对数P=1.598)和溶酶体靶向性。

（4）用于 ROS 检测的荧光探针

   ROS 检测探针需同时满足 BBB 穿透性与 ROS 响应性两大核心要求：BBB 穿透优化以及ROS 响应机制：基于 ROS 的氧化特性设计特异性识别基团，如利用硼酸酯、硫醚、芳香胺等结构与 ROS的氧化反应，实现荧光信号的“点亮” 或波长位移，确保检测的高选择性。其关键技术策略在于两个方面：一是结构模块化设计：将 NIR 荧光团（如 Cy5.5、ICG 衍生物）、ROS 识别基团与 BBB 靶向单元（如转铁蛋白肽段、TAT 肽）通过可降解 linker 连接，实现 “穿透 - 识别 - 成像” 一体化功能。二是纳米载体递送：将小分子 ROS 探针封装于聚乙二醇（PEG）修饰的脂质体或聚合物纳米粒，通过尺寸效应（10-100 nm）促进 BBB 内皮细胞的胞饮作用，同时减少探针被外排转运体（如 P - 糖蛋白）清除的效率。三是双光子响应增强：引入双光子吸收基团，利用长波长激发减少生物组织光损伤，提升脑深部（>500 μm）ROS 检测的时空分辨率。
其中代表性探针应用案例如下：

   次氯酸（HOCl）检测：如图7展示的探针17-24，针对 AD 模型小鼠设计的探针通过吩噻嗪氧化显色机制，在脑内 Aβ 斑块周围实现 HOCl 的原位成像，首次直观证实 HOCl 积累与 Aβ 聚集的空间关联性，为 AD 氧化应激假说提供实验依据。

   过氧化氢（H₂O₂）追踪：如图8所示探针25-30，利用硼酸盐与 H₂O₂的特异性反应设计的近红外探针，实现帕金森病模型小鼠黑质区 H₂O₂水平的长期动态监测，发现其浓度变化先于多巴胺能神经元丢失，为 PD 早期预警提供潜在标志物。

   超氧阴离子（O₂⁻）监测：如图9-10所示探针31-38，基于香豆素 - 罗丹明荧光共振能量转移（FRET）原理构建的探针，成功捕捉癫痫小鼠发作期海马区 O₂⁻的瞬时爆发，其信号强度与脑电图（EEG）异常放电频率呈正相关，揭示 O₂⁻在神经元过度兴奋中的调控作用。

(5) 用于 RSS 检测的荧光探针

以下是用于检测RSS探针的反应位点（图11）：

   活性硫物种（RSS）包含生物硫醇（如谷胱甘肽 GSH、半胱氨酸 Cys、高半胱氨酸 Hcy）、硫化氢（H₂S）、二氧化硫（SO₂）、多硫化氢（H₂Sₙ）及硫烷硫等，在细胞的信号传导、抗氧化过程以及神经炎症等生理病理进程中发挥着关键作用。由于其在生理环境中不稳定且反应活性高，开发能在生物体系内快速、特异地检测各类 RSS 的荧光探针，对深入研究RSS 的功能和作用机制至关重要。

   如图12，在生物硫醇检测方面，探针 39 以香豆素作为荧光团，利用硫代苯甲酸酯与 Cys 的特异性亲核加成反应，形成稳定的五元环，进而恢复荧光。该探针具备双光子性能，可直接监测抑郁模型小鼠脑内 Cys 水平的显著下降，为深入理解抑郁症发病机制提供了关键信息。探针 40 采用与探针 39 相同的识别基序，实现了对线粒体的靶向。通过评估氧化应激条件下抗抑郁药物对PC12 细胞 Cys 水平的影响，并观察小鼠脑内线粒体 Cys 的波动情况，有效验证了药物在体内的疗效。探针 41 以马来酰亚胺作为识别受体，借助与 Cys 的 Michael 加成反应，快速结合并减弱光诱导电子转移（PET）效应，使得荧光得以恢复。此探针对 Cys 的选择性高于其他生物硫醇，且具有高效的血脑屏障（BBB）穿透性，能够用于氧化应激诱导的抑郁模型小鼠脑内 Cys 的检测。探针 42 基于丙烯酸酯作为 Cys 特异性识别位点，通过共轭加成 - 环化及 1,6 - 消除反应，在 700 nm 处产生强荧光。它拥有优异的 BBB 渗透性，成功监测了癫痫发作及抗癫痫药物治疗过程中小鼠脑内 Cys 水平的波动，为癫痫的研究和治疗提供了有力的监测手段。探针 43 整合了萘酰亚胺和磺酰胺结构，能够靶向 NMDA 受体附近的 GSH。其具有高选择性，可通过双光子显微镜进行深层组织成像，为监测神经元附近GSH 水平提供了有效工具，有助于推动神经元活性相关研究的进展。探针 44 基于分子内电荷转移（ICT）机制，以 2,4 - 二硝基苯磺酸作为 GSH 响应基团，实现近红外发射。该探针光学性能稳定，组织穿透性强，能够清晰成像秀丽隐杆线虫及小鼠脑切片中 GSH 浓度的变化，为研究 GSH 在不同生物模型中的作用提供了良好的可视化手段。探针 45 以 2,4 - 二硝基苯磺酸修饰的 BODIPY 为荧光团，并引入三乙二醇单甲醚修饰的苯乙烯以增强 BBB 渗透性。它能够高时空分辨率地监测中风小鼠原位铁死亡过程中 GSH 的变化，发现 GPX4 表达受抑可通过 p62 - Keap1 通路诱发铁死亡，为中风相关病理机制的研究提供了新的见解。

   如图13，对于硫化氢（H₂S）的检测，探针 46 整合了 1,8 - 萘二甲酰亚胺（用于 H₂S 识别）和罗丹明衍生物（用于 ATP 捕获），实现了双靶点成像。通过该探针发现 AD 小鼠脑内 H₂S 和 ATP 浓度低于野生型（WT）小鼠，并且揭示了 H₂S 通过调控线粒体呼吸链关键蛋白来维持 ATP 稳态的作用，同时可直接用于评估 AD 药物的疗效，为 AD 的研究和药物开发提供了新的视角和工具。探针 47 基于 ICT 效应，在绿色荧光响应 H₂S 的同时，通过分子旋转限制，在高粘度环境下释放红色荧光，实现了对线粒体的靶向。在 PD 模型线粒体中，该探针检测到低H₂S 水平和高粘度，能够原位监测线粒体 H₂S 的动态变化，为 PD 的病理研究提供了有关线粒体相关指标变化的重要信息。探针 48 基于硫醇裂解机制，在酯酶和生物硫醇存在的条件下，释放 H₂S 和 NBD 配体，伴随荧光 “开启”。在神经母细胞瘤细胞（SH - SY5Y）中，该探针成功检测到 H₂S，并在 AD 小鼠模型中监测到 H₂S 的释放，证实了 H₂S 对 Aβ fibrils 的解聚作用，为 AD 的治疗提供了新的策略方向。探针 49 以刚性脂溶性硅罗丹明 B 为荧光团，结合半花菁调节脂水分配系数（clog P），通过 HS⁻的亲核加成反应降低荧光发射峰。此探针具有优异的 BBB 渗透性，发现精神分裂症（SZ）小鼠脑内 H₂S 水平异常升高，而利培酮治疗可降低其水平，长期治疗或可使 H₂S 水平恢复至正常，为精神分裂症的病理研究和治疗药物评估提供了重要依据。

   如图14，在二氧化硫（SO₂）检测方面，探针 50 以苯并吡喃基团作为 SO₂识别单元，连接喹啉荧光团，能够可逆结合亚硫酸盐（SO₃²⁻，SO₂的水溶液形式）。该探针具有良好的水溶性和线粒体靶向性，可实时监测 PBS 溶液及小鼠脑组织中 SO₂水平。然而，其长波长发射强度较低，在一定程度上限制了其在体内的广泛应用。探针 51 基于 TBET（通过键能转移）系统，以香豆素衍生物作为能量供体、半花菁作为受体，与SO₂反应后触发 TBET 开关。该探针检测限低（0.09 μM）、光谱间隙大（Δλ = 118 nm），能量转移效率高达 90.5%。在细胞、脑组织及活鼠中均能有效检测 SO₂，并且发现 SO₂升高会降低脑内谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽 S - 转移酶（GST）水平，而 NS - 398 可缓解 SO₂诱导的神经炎症，为研究 SO₂与神经炎症的关系及相关药物研发提供了重要工具。

   对于多硫化氢（H₂Sₙ）和硫烷硫的检测，探针 52 以 2 - 氟 - 5 - 硝基苯甲酸酯作为识别基团，近红外荧光团 BCy - Keto 作为信号单元，与 H₂Sₙ反应后在 727 nm 发射荧光。在缺氧模型中，该探针揭示了硫代亚硝酸（HSNO）通过介导 H₂Sₙ水平升高来保护斑马鱼缺氧过程，为 H₂Sₙ的神经保护作用提供了有力证据。探针 53 以半花菁染料 HCy - SH 为基础，硫烷硫与巯基（ - SH）结合后发生分子内环化，释放母体半花菁并伴随吸收光谱红移（622 nm→720 nm）。它是首个硫烷硫激活的光声（PA）成像探针，可监测脑缺血损伤小鼠模型中硫烷硫水平的变化，实现疾病的可视化诊断，为急性脑缺血的治疗提供了重要的指导依据。此外，还有一些多响应 RSS 检测探针，可同时区分多种生物硫醇或整合其他检测指标，提高在复杂生物环境中对 RSS 分析的准确性。例如，探针54 基于 BODIPY 的双结合位点设计，通过硫醇 - 卤素的亲核芳香取代（SNAr）及氨基重排反应，实现对 Hcy、Cys、GSH 的比率型荧光区分。该探针可在50 s 内快速定量 Hcy，在脑缺血小鼠模型中观察到神经元内 Hcy 水平升高，提示其与 AD 和中风恶化相关，为相关疾病的早期诊断和病情评估提供了新的检测手段。探针55 以香豆素为荧光团，通过N,N - 二甲基丙酸酯取代抑制TICT（扭曲分子内电荷转移），增强荧光性能和 BBB 渗透性，以正丁基硫基作为硫醇识别基团。它可在不同激发 / 发射通道同时区分 Hcy、Cys 和 GSH，首次在活细胞、脑组织及小鼠中观察到 AD 和 PD 模型中 Hcy 和 Cys 水平升高，并能定量人血清中这三种生物硫醇的含量，为多种神经疾病的研究和临床诊断提供了全面且准确的检测方法。探针 58 以 4 - 吡啶羧酸酯作为新识别基序，优化了 BBB 渗透性；探针 59 引入溴离子进一步增强 BBB 穿透性，二者均通过生物硫醇的亲核取代反应激活荧光。探针 58 用于癫痫小鼠脑内硫醇动态成像；探针 59 揭示脑缺血再灌注（CIRI）中生物硫醇通过 NF - κB 经典 / 非经典通路诱导 ROS 产生，而依达拉奉可清除自由基减轻神经元损伤，为癫痫和脑缺血再灌注相关研究及治疗提供了重要的监测和作用机制研究工具。
（6）用于蛋白质检测的荧光探针

   在用于蛋白质检测的荧光探针研究中，重点聚焦于与神经退行性疾病密切相关的淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白。针对Aβ检测，探针60通过将ONOO⁻反应触发器与Aβ斑块结合荧光团连接，凭借小分子量和优异性脂溶性实现BBB穿透，可同步观察Aβ斑块与ONOO⁻的分布及正反馈机制；探针61能同时抑制NLRP3炎症小体激活与Aβ聚集，减少炎症因子并减轻Aβ相关毒性；探针62通过引入疏水基团增强对Aβ₄₂与Aβ₄₀ protofibrils的区分能力；光激活探针63-3经光照后荧光强度显著提升，成功应用于体内Aβ斑块成像；基于硫代黄素T（ThT）的探针64-1和64-2借助纳米载体穿越BBB，实现Aβ₁₋₄₂的体内成像；探针65-2通过调节TICT效应增强荧光，实现老龄小鼠Aβ沉积的3D成像并揭示褪黑素的干预作用；姜黄素衍生物探针如CRANAD-2及其优化版本（如探针67、68）通过结构修饰增强BBB穿透性与荧光性能，实现Aβ斑块的特异性成像；AIE探针75和76通过引入硫吩桥和亲水基团平衡脂溶性，抑制Aβ聚集并实现高保真成像。针对tau蛋白检测，探针80系列基于融合七环三烯结构的BODIPY scaffold，具有高BBB穿透性，用于AD转基因小鼠神经原纤维缠结（NFTs）成像；喹啉基探针81系列通过共轭键桥连供体-受体框架，特异性靶向tau聚集；探针82通过引入甲氧基侧取代增强与tau蛋白的氢键作用，提升选择性；AIE活性探针85通过磺酸化烷基链改善亲水性，实现tau原纤维的高亲和力成像与tau蛋白和Aβ的区分。此外，多响应探针86在NIR窗口实现Aβ和tau聚集的非侵入成像，荧光寿命变化提升检测灵敏度；探针87-2则成功在小鼠和果蝇AD模型中标记Aβ，用于临床前筛选。这些探针通过结构优化与机制创新，为AD等神经退行性疾病的诊断、机制研究及药物筛选提供了有力工具。

（7）用于去甲肾上腺素检测的荧光探针

   在用于去甲肾上腺素（NE）检测的荧光探针研究中，针对NE的化学结构特点及检测需求开发了多种探针。探针88可直接观察胞吐过程中释放的NE等神经递质，但对NE缺乏特异性；探针89利用喹诺酮荧光团上的苯硼酸基团对儿茶酚胺的高亲和力，实现NE的荧光“开启”响应，并能观察细胞分裂时单个发色团的脱色过程；探针90基于柱状芳香分子构建双位点识别平台，上端硼硼酸修饰萘酰亚胺与儿茶酚类神经递质作用，下端醛基香豆素衍生物与单胺类反应，通过静电作用吸引带电神经递质，产生独特荧光响应但需进一步优化以实现脑内应用。探针91基于液/液界面均相形成的功能化金纳米粒子阵列构建SERS平台，通过双位点识别机制定量检测NE，结合微透析技术成功量化应激刺激后小鼠脑内NE水平。探针92以螺环荧光素与4-甲基硫酚结合，通过分子内环化反应实现NE可视化，但水溶性和发射波长限制其体内应用；优化后的探针93以酞菁为荧光团并引入磺酸盐，成功标记PC12细胞囊泡中的NE，首次可视化抗抑郁药物对小鼠脑内NE的干扰效应。探针94通过烷基链连接两个苯基吡啶𬭩确保水溶性和构象灵活性，引入S-对甲苯基硫代碳酸酯实现NE选择性识别，借助分子构象折叠和水桥联双重加速机制快速检测NE，揭示AD模型小鼠脑内NE水平下调；进一步优化的探针95系列引入磺酸盐亲水基团改善BBB穿透性，成功可视化PD模型小鼠脑内NE水平下调。探针96采用“捕猎-发射”策略，通过醛基快速结合NE氨基并经分子内环化释放荧光团，卤素修饰优化理化性质实现BBB穿透，精准捕获细胞内NE从释放到再摄取的动态过程，揭示癫痫状态下小鼠脑内NE分布和浓度变化。探针97-3通过香豆素与吡喃盐偶联构建FRET双通道荧光探针，利用NE分子内氢键促进亲核反应，为嗜铬细胞瘤的及时诊断提供工具。这些探针通过设计特异性识别机制和优化理化性质，为NE的生理功能研究、相关疾病诊断及药物评估提供了有力支持。

三、研究结论与展望

   本研究系统综述了近年来探针穿透 BBB 的策略创新与脑动态荧光成像技术的突破，核心结论包括：探针的理化特性优化与主动靶向策略是提升 BBB 穿透效率的关键，纳米载体与物理辅助技术可进一步增强递送特异性；响应型荧光探针与高分辨率成像技术的结合，实现了脑内生理信号、病理标志物的实时原位监测，为脑部疾病机制研究提供了直接证据；多模态成像（如荧光成像与 MRI/PET 结合）可整合结构与功能信息，提升脑动态解析的全面性。未来研究需重点突破：提高探针的生物相容性与长期稳定性，降低免疫原性与毒性；增强成像技术的组织穿透深度与时间分辨率，实现全脑范围的动态监测；推动技术从动物实验向临床转化，为脑部疾病的精准诊断与治疗提供实用工具。该领域的进展将持续推动脑科学基础研究与临床应用的融合，为攻克脑部疾病难题提供重要支撑。